GlcNAc kinase Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-407809-ACT

NAGK codifica la chinasi umana della GlcNAc, un enzima citosolico che fosforila la N-acetilglucosamina a GlcNAc-6-fosfato, collegando la via di recupero (salvage) della GlcNAc al metabolismo delle esosamine. Questa attività contribuisce alla produzione di UDP-GlcNAc, un substrato donatore centrale per la glicosilazione N- e O-linked e per altri processi dipendenti dai glicani che regolano il ripiegamento proteico, il traffico intracellulare e la trasduzione del segnale. Influenzando la capacità di glicosilazione, NAGK può incidere sulle risposte cellulari alla disponibilità di nutrienti e allo stress, con effetti a valle sui programmi di crescita e differenziamento cellulare. Un flusso delle esosamine e una glicosilazione deregolati sono caratteristiche ricorrenti in contesti patologici metabolici e proliferativi, rendendo NAGK un nodo utile per l’analisi meccanicistica delle vie di segnalazione.

GlcNAc kinase Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di NAGK senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

GlcNAc kinase Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus NAGK nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione NAGK, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di GlcNAc kinase. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus NAGK nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da GlcNAc kinase nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via GlcNAc kinase nelle cellule tumorali con espressione di NAGK silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.