girdin Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402236-ACT

Il gene umano CCDC88A codifica per girdin, una grande proteina scaffold legante l’actina che integra la segnalazione dei fattori di crescita e dei GPCR con il rimodellamento del citoscheletro, coordinando la polarità cellulare, la migrazione direzionata e l’adesione. Girdin agisce a valle di PI3K–AKT e interagisce con le proteine G eterotrimeriche e con regolatori della polarità per influenzare la formazione di lamellipodi, il traffico vescicolare e la dinamica della segnalazione recettoriale. Attraverso questi ruoli, CCDC88A contribuisce a processi quali l’estensione dei neuriti e l’organizzazione epiteliale; inoltre, un’espressione alterata o un accoppiamento anomalo della segnalazione è stato associato a fenotipi di motilità e sopravvivenza aberranti osservati nel cancro e in altri contesti di malattie proliferative o neurosviluppative. La connettività delle sue vie di segnalazione rende CCDC88A un nodo utile per analizzare come l’architettura del citoscheletro moduli la trasduzione del segnale e le transizioni di stato cellulare.

girdin Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di CCDC88A senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

girdin Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus CCDC88A nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione CCDC88A, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di girdin. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus CCDC88A nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da girdin nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via girdin nelle cellule tumorali con espressione di CCDC88A silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.