Gemin8 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-404145-ACT

GEMIN8 codifica Gemin8, un componente centrale del complesso SMN–Gemin che supporta l’assemblaggio delle piccole ribonucleoproteine nucleari spliceosomali (snRNP) necessarie per lo splicing del pre‑mRNA. Attraverso il suo ruolo nella biogenesi delle snRNP e nell’omeostasi dello spliceosoma, Gemin8 contribuisce alla fedeltà del processamento dell’RNA e a una più ampia regolazione dei programmi di espressione genica. L’alterazione dell’attività del complesso SMN è associata a meccanismi di malattie neuromuscolari e del neurosviluppo e può influire sulla vitalità cellulare e sulle risposte allo stress tramite un metabolismo dell’RNA modificato. GEMIN8 è quindi rilevante per lo studio di vie associate allo spliceosoma, dell’assemblaggio di complessi RNA‑proteina e della disregolazione del trascrittoma, rilevante per la malattia, nelle cellule umane.

Gemin8 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di GEMIN8 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Gemin8 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus GEMIN8 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione GEMIN8, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Gemin8. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus GEMIN8 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Gemin8 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Gemin8 nelle cellule tumorali con espressione di GEMIN8 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.