Plásmido CRISPR de Activación (h) GADD 34: sc-400595-ACT

PPP1R15A codifica GADD34, una subunidad reguladora de la proteína fosfatasa 1 que favorece la desfosforilación de eIF2α para dar por terminada la respuesta integrada al estrés y restablecer la síntesis global de proteínas tras el estrés celular. Inducida aguas abajo de la señalización ATF4/CHOP, GADD34 actúa como un nodo clave de retroalimentación dentro de las vías de estrés del RE y de la respuesta a proteínas mal plegadas (UPR), modulando la proteostasis, la sensibilidad a la apoptosis y la recuperación tras la detención de la traducción. Por su influencia en la señalización adaptativa al estrés, PPP1R15A se estudia en contextos que incluyen inflamación, estrés metabólico, neurodegeneración y supervivencia de células tumorales, donde respuestas al estrés desreguladas pueden contribuir a fenotipos de enfermedad. Su actividad también se entrecruza con programas asociados al estrés oxidativo y al daño del ADN, lo que la convierte en una diana útil para el análisis mecanístico de redes de señalización del estrés.

GADD 34 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de PPP1R15A sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

GADD 34 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus PPP1R15A en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional PPP1R15A, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de GADD 34. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo PPP1R15A y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de GADD 34 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía GADD 34 en células tumorales con expresión de PPP1R15A silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.