GABA_A Rε Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-405545-ACT

GABRE codifica la subunità ε del recettore umano GABA\_A, un canale del cloruro regolato da ligando che media la rapida neurotrasmissione inibitoria nel sistema nervoso centrale. L’incorporazione della subunità ε può modificare il gating del recettore, la farmacologia e la cinetica di desensibilizzazione, plasmando l’eccitabilità neuronale e l’inibizione sinaptica. La segnalazione del recettore GABA\_A è una componente fondamentale delle vie dei canali ionici attivati da neurotrasmettitori che regolano il potenziale di membrana, le oscillazioni di rete e la plasticità dipendente dall’attività. Un tono GABAergico disregolato e una composizione alterata delle subunità del recettore sono stati associati a fenotipi neuropsichiatrici e correlati alle crisi epilettiche, motivando studi meccanicistici sulla funzione specifica delle subunità.

GABAA Rε Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di GABRE senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

GABAA Rε Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus GABRE nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione GABRE, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di GABAA Rε. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus GABRE nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da GABAA Rε nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via GABAA Rε nelle cellule tumorali con espressione di GABRE silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.