GABA_A Rδ Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401954-ACT

GABRD codifica la subunità δ del recettore umano GABA\_A, un canale del cloro attivato da ligando che media l’inibizione tonica della neurotrasmissione nel sistema nervoso centrale. L’incorporazione della subunità δ nei complessi recettoriali extrasinaptici conferisce un’elevata sensibilità al GABA ambientale e contribuisce a una conduttanza al cloro sostenuta che modella l’eccitabilità neuronale e le oscillazioni di rete. Attraverso la regolazione del tono inibitorio, la segnalazione mediata dal recettore GABA\_A con subunità δ si integra con la plasticità sinaptica, la modulazione da parte di neurosteroidi in risposta allo stress e l’equilibrio eccitazione–inibizione. Alterazioni dell’espressione di GABRD o della composizione del recettore sono state associate nella ricerca a fenotipi neuropsichiatrici e neurologici caratterizzati da una segnalazione inibitoria compromessa, inclusi una maggiore suscettibilità alle crisi e endofenotipi correlati all’umore.

GABAA Rδ Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di GABRD senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

GABAA Rδ Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus GABRD nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione GABRD, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di GABAA Rδ. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus GABRD nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da GABAA Rδ nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via GABAA Rδ nelle cellule tumorali con espressione di GABRD silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.