Frizzled-4 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402355-ACT

FZD4 codifica Frizzled-4, un recettore a sette domini transmembrana che lega i ligandi WNT per avviare la segnalazione canonica mediata da β-catenina e vie non canoniche che regolano la polarità cellulare, la migrazione e la dinamica del citoscheletro. Nell’endotelio vascolare e nei tessuti neurali, Frizzled-4 contribuisce al rimodellamento angiogenico e a programmi trascrizionali associati alla funzione di barriera attraverso complessi con i co-recettori WNT. Alterazioni della segnalazione di FZD4 sono state collegate a una deregolazione dell’output della via WNT, con effetti sul patterning dello sviluppo e sull’omeostasi tissutale. Studi genetici e funzionali associano FZD4 alla biologia vascolare della retina e a vitreoretinopatie ereditarie correlate, rendendolo un nodo utile per indagare fenotipi vascolari guidati da WNT.

Frizzled-4 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di FZD4 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Frizzled-4 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus FZD4 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione FZD4, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Frizzled-4. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus FZD4 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Frizzled-4 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Frizzled-4 nelle cellule tumorali con espressione di FZD4 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.