Filamin 1 Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-431396-ACT

Il gene Flna del topo codifica la filamina 1, una proteina scaffold ad alto peso molecolare che lega l’actina, reticola la F-actina e collega il citoscheletro ai recettori transmembrana per regolare la forma cellulare, l’adesione e la meccanosensibilità. La filamina 1 organizza hub di segnalazione per l’adesione dipendente dalle integrine, il turnover delle adesioni focali e il rimodellamento del citoscheletro guidato dalle GTPasi della famiglia Rho, influenzando la migrazione e la morfogenesi tissutale. Attraverso interazioni con proteine di membrana e di segnalazione, modula processi quali endocitosi, stabilità di membrana e programmi trascrizionali responsivi alle forze. Una funzione di FLNA deregolata è stata collegata a fenotipi dello sviluppo e neurovascolari ed è ampiamente studiata per i suoi ruoli nella motilità cellulare, nell’integrità delle barriere e nelle reti di segnalazione del citoscheletro.

Filamin 1 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Flna senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Filamin 1 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Flna nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Flna, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Filamin 1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Flna nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Filamin 1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Filamin 1 nelle cellule tumorali con espressione di Flna silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.