FGFR-5 Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-431146-ACT

Mouse Fgfrl1 codifica FGFR-5, una proteina atipica simile ai recettori del fattore di crescita dei fibroblasti, in grado di modulare gli output della segnalazione FGF influenzando la disponibilita dei ligandi e la dinamica dei complessi recettoriali. FGFR-5 e implicato nella regolazione di processi di sviluppo, tra cui l’organogenesi, la definizione dei pattern tissutali e le interazioni cellula–cellula, con effetti a valle su vie comunemente associate alla biologia dei FGFR, come la segnalazione MAPK/ERK e PI3K/AKT. Nei sistemi mammiferi, un’alterata funzione di FGFRL1 e stata associata a difetti di morfogenesi e dello sviluppo cardiopolmonare, a supporto della sua rilevanza nei meccanismi delle malattie congenite. In quanto membro non canonico della famiglia dei recettori, FGFR-5 rappresenta un utile punto di ingresso per analizzare come la regolazione fine della via FGF influenzi la differenziazione e l’omeostasi dei tessuti.

FGFR-5 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Fgfrl1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

FGFR-5 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Fgfrl1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Fgfrl1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di FGFR-5. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Fgfrl1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da FGFR-5 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via FGFR-5 nelle cellule tumorali con espressione di Fgfrl1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.