FBXW5 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-404410-ACT

FBXW5 codifica un recettore di substrato contenente un dominio F-box e ripetizioni WD all’interno dei complessi di ubiquitina ligasi E3 di tipo SCF (SKP1–CUL1–F-box), che conferiscono specificità del bersaglio alla degradazione proteasomiale mediata dall’ubiquitina. Attraverso il turnover regolato di proteine coinvolte nella segnalazione e nel ciclo cellulare, FBXW5 contribuisce al controllo della proteostasi, al coordinamento dei checkpoint e alla modulazione di vie collegate alla crescita e alle risposte allo stress. Un’attività alterata del sistema ubiquitina–proteasoma che coinvolge proteine F-box è spesso associata a proliferazione deregolata e instabilità genomica, rendendo FBXW5 un nodo rilevante per studi meccanicistici in biologia del cancro e in fenotipi cellulari correlati. In quanto gene umano, FBXW5 viene comunemente studiato per comprendere come il riconoscimento dei substrati e la cinetica di degradazione rimodellino l’output delle vie in specifici contesti cellulari.

FBXW5 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di FBXW5 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

FBXW5 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus FBXW5 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione FBXW5, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di FBXW5. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus FBXW5 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da FBXW5 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via FBXW5 nelle cellule tumorali con espressione di FBXW5 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.