FAM20A CRISPR Activation Plasmid (h): sc-409969-ACT

FAM20A kodiert ein sezerniertes und Golgi-assoziiertes Protein, das als katalytisch inaktives Mitglied der FAM20-Familie fungiert und als regulatorischer Partner von FAM20C wirkt, wodurch es die Phosphorylierung extrazellulärer und sezernierter Proteine beeinflusst. Über diese Modulation der Signalübertragung im sekretorischen Weg trägt FAM20A zur Organisation der extrazellulären Matrix, zur Schmelzbildung und zu mineralisationsassoziierten Prozessen in epithelialen und odontogenen Geweben bei. Eine veränderte FAM20A-Aktivität wurde mit Defekten der Amelogenese und Phänotypen ektoper Verkalkung in Verbindung gebracht, was seine Relevanz für Biomineralisation und Mechanismen der Gewebehomöostase unterstreicht. Diese Eigenschaften machen FAM20A zu einem nützlichen Ziel für die Untersuchung der Regulation des sezernierten Phosphoproteoms, des Matrix-Remodelings und von Differenzierungsprogrammen in humanen Zellmodellen.

FAM20A Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen FAM20A-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

FAM20A Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des FAM20A-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der FAM20A-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen FAM20A-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native FAM20A-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von FAM20A-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des FAM20A-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem FAM20A-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.