FAM198B Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-409269-ACT

FAM198B (família com similaridade de sequência 198, membro B) codifica uma proteína humana pouco caracterizada, com ligações emergentes a processos associados à membrana e à sinalização intracelular que influenciam o estado celular e a organização dos tecidos. Estudos transcriptómicos relataram uma regulação dependente do contexto de FAM198B em múltiplos tipos celulares, sugerindo potenciais papéis em vias que governam a diferenciação, a adesão e programas transcricionais responsivos ao stress. Alterações na expressão de FAM198B foram observadas em conjuntos de dados associados a doenças, apoiando a sua utilidade como um nó molecular para o estudo da regulação génica na fisiopatologia. Como as anotações mecanísticas permanecem limitadas, a modulação controlada de FAM198B endógeno fornece uma abordagem viável para mapear redes génicas e fenótipos a jusante.

FAM198B O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de FAM198B sem alterar a sequência de ADN subjacente.

FAM198B O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus FAM198B em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição FAM198B, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de FAM198B. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus FAM198B nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de FAM198B no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via FAM198B em células tumorais com expressão de FAM198B silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.