FADD Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400580-ACT

La FADD umana (Fas-associated protein with death domain) è una molecola adattatrice che trasduce i segnali provenienti dai recettori della morte, inclusi FAS e membri della famiglia TNFRSF, per avviare l’apoptosi estrinseca. Facendo da ponte tra i complessi recettoriali e le caspasi iniziatrici come CASP8 attraverso interazioni omotipiche del death domain, FADD regola l’attivazione della cascata delle caspasi, la morte cellulare programmata e l’omeostasi immunitaria. Oltre all’apoptosi, FADD influenza, in modo dipendente dal contesto, la segnalazione di NF-κB, le risposte infiammatorie e il controllo del ciclo cellulare. Una segnalazione di FADD deregolata è stata implicata nella competenza apoptotica alterata e nella disregolazione immunitaria osservate in diversi modelli di cancro e di malattie infiammatorie.

FADD Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di FADD senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

FADD Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus FADD nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione FADD, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di FADD. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus FADD nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da FADD nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via FADD nelle cellule tumorali con espressione di FADD silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.