EXTL1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-409470-ACT

L’EXTL1 umano (exostosin-like glycosyltransferase 1) è un enzima residente nell’apparato di Golgi implicato nell’avvio e nell’allungamento delle catene di glicosaminoglicani eparan solfato su proteine core di proteoglicani. Modellando la struttura dell’eparan solfato, EXTL1 influenza l’organizzazione della matrice extracellulare e le interazioni ligando–recettore che modulano la segnalazione dei fattori di crescita, i gradienti di morfogeni e la comunicazione cellula–cellula. Questi processi collegano EXTL1 a vie che regolano adesione, migrazione e differenziamento, in cui un’alterata biosintesi dei proteoglicani può compromettere l’omeostasi tissutale. Una sintesi deregolata dell’eparan solfato è stata associata ad anomalie dello sviluppo e a una riorganizzazione della segnalazione rilevante per la malattia, rendendo EXTL1 un bersaglio utile per studi meccanicistici di glicobiologia nelle cellule umane.

EXTL1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di EXTL1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

EXTL1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus EXTL1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione EXTL1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di EXTL1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus EXTL1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da EXTL1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via EXTL1 nelle cellule tumorali con espressione di EXTL1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.