ESAM Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-413872-ACT

La molecola di adesione selettiva delle cellule endoteliali (ESAM) è una proteina di membrana della superfamiglia delle immunoglobuline, arricchita nelle giunzioni serrate endoteliali, dove supporta l’adesione cellula-cellula, l’integrità della barriera vascolare e la migrazione transendoteliale dei leucociti. ESAM partecipa all’organizzazione delle giunzioni e alla regolazione del citoscheletro insieme ad altri complessi di adesione endoteliale, influenzando il rimodellamento angiogenico e il traffico infiammatorio. Un’alterata espressione di ESAM è stata associata a disfunzione vascolare, angiogenesi associata ai tumori e contesti di malattie infiammatorie in cui la permeabilità endoteliale e l’infiltrazione di cellule immunitarie risultano disregolate. In quanto marcatore giunzionale e regolatore funzionale, ESAM è comunemente studiata nei processi di differenziamento endoteliale, nei saggi di permeabilità vascolare e nei modelli di infiammazione guidata dal microambiente.

ESAM Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di ESAM senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

ESAM Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus ESAM nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione ESAM, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di ESAM. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus ESAM nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da ESAM nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via ESAM nelle cellule tumorali con espressione di ESAM silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.