Erythropoietin/EPO Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400283-ACT

EPO codifica l’eritropoietina, un ormone glicoproteico secreto che regola la sopravvivenza, la proliferazione e la differenziazione dei progenitori eritroidi principalmente tramite l’interazione con EPOR e la segnalazione a valle JAK2/STAT5, con contributi aggiuntivi delle vie PI3K/AKT e MAPK. La sua espressione è controllata in modo rigoroso dai meccanismi di rilevamento dell’ossigeno, in particolare dalla regolazione trascrizionale dipendente da HIF, che collega lo stress ipossico all’eritropoiesi. La deregolazione della segnalazione EPO/EPOR e i programmi di risposta all’ossigeno alterati sono rilevanti per la biologia dell’anemia, la policitemia e gli adattamenti associati all’ipossia tumorale, e sono frequentemente studiati in sistemi modello ematopoietici, renali e oncologici. EPO è inoltre utilizzata come readout dell’attività della via dell’ipossia e come marcatore di cambiamenti dello stato cellulare che influenzano la secrezione endocrina di citochine.

Erythropoietin/EPO Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di EPO senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Erythropoietin/EPO Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus EPO nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione EPO, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Erythropoietin/EPO. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus EPO nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Erythropoietin/EPO nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Erythropoietin/EPO nelle cellule tumorali con espressione di EPO silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.