ENT2 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401952-ACT

Il gene umano SLC29A2 codifica il trasportatore equilibrativo di nucleosidi 2 (ENT2), un trasportatore bidirezionale della membrana plasmatica che facilita il flusso di nucleosidi purinici e pirimidinici attraverso le membrane cellulari in modo indipendente dal Na+. ENT2 contribuisce a regolare la via di recupero (salvage) dei nucleosidi, i pool intracellulari di nucleotidi e la gestione dell’adenosina extracellulare, collegando il trasporto di membrana alla sintesi di DNA/RNA, al metabolismo energetico e alla segnalazione purinergica. Influenzando la disponibilità di substrato per la biosintesi dei nucleotidi e l’ingresso/efflusso di farmaci, ENT2 è rilevante per studi sul controllo della proliferazione, sulle risposte allo stress metabolico e sulla sensibilità agli analoghi nucleosidici nei sistemi modello. Alterazioni del trasporto dei nucleosidi e dell’omeostasi delle purine sono state implicate in contesti fisiopatologici che includono l’infiammazione, la segnalazione correlata all’ischemia e la biologia tumorale, a supporto dell’uso di strumenti incentrati su ENT2 per interrogare fenotipi guidati dal trasporto.

ENT2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di SLC29A2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

ENT2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus SLC29A2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione SLC29A2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di ENT2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus SLC29A2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da ENT2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via ENT2 nelle cellule tumorali con espressione di SLC29A2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.