Endophilin III Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403821-ACT

SH3GL3 codifica l’endofillina III, una proteina di rimodellamento di membrana contenente un dominio BAR che partecipa all’endocitosi mediata da clatrina e al riciclo delle vescicole sinaptiche, rilevando e generando curvatura di membrana. L’endofillina III si coordina con la dinamina e altri adattatori endocitici per promuovere la gemmazione e il traffico vescicolare, collegando la dinamica di membrana all’organizzazione del citoscheletro e all’internalizzazione dei recettori. L’espressione di SH3GL3 è arricchita nei tessuti neuronali ed è comunemente studiata nelle vie che regolano la neurotrasmissione, il turnover vescicolare e la segnalazione intracellulare. Alterazioni della regolazione endocitica e del ciclo delle vescicole sinaptiche sono spesso implicate nei meccanismi di malattie di ambito neurobiologico, rendendo SH3GL3 un bersaglio utile per studi meccanicistici della funzione neuronale e dei difetti di traffico di membrana.

Endophilin III Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di SH3GL3 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Endophilin III Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus SH3GL3 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione SH3GL3, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Endophilin III. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus SH3GL3 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Endophilin III nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Endophilin III nelle cellule tumorali con espressione di SH3GL3 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.