Plasmide CRISPR d'Activation (h) endobrevin: sc-403438-ACT

Le gène humain VAMP8 code l’endobrévine, une protéine SNARE associée aux vésicules qui médie les événements de fusion membranaire nécessaires au trafic endosomal, à l’exocytose régulée et à la sécrétion des granules. L’endobrévine participe à l’assemblage des complexes SNARE avec des partenaires de la membrane plasmique afin de contrôler l’amarrage et la fusion des vésicules dans les cellules immunitaires, les plaquettes et les compartiments épithéliaux, influençant des processus tels que la dégranulation, la libération de cytokines et la sécrétion de mucines. Par ces fonctions, VAMP8 intervient dans des voies de transport vésiculaire qui modulent la signalisation inflammatoire, l’hémostase et la défense de l’hôte. Une dérégulation du trafic dépendant de VAMP8 a été associée dans la littérature à des altérations de la fonction sécrétoire et à des phénotypes inflammatoires, ce qui souligne sa pertinence pour des études mécanistiques de la fusion vésiculaire et de la biologie des maladies liées à la sécrétion.

endobrevin Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de VAMP8 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

endobrevin Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus VAMP8 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription VAMP8, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de endobrevin. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus VAMP8 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de endobrevin au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie endobrevin dans les cellules tumorales présentant une expression de VAMP8 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.