Endo180 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-403483-ACT

MRC2 codifica o Endo180 (uPARAP), um recetor endocítico transmembranar da família do recetor da manose que se liga a colagénios e a outros ligandos da matriz extracelular e os internaliza para degradação lisossomal. A atividade do Endo180 sustenta a renovação da matriz extracelular, a adesão e migração celulares e a remodelação do microambiente tumoral através de vias de captação e tráfego de colagénio acopladas ao processamento endossómico–lisossomal. O recetor é frequentemente estudado em fibroblastos, células da linhagem de macrófagos e modelos de carcinoma invasivo, nos quais a dinâmica do colagénio molda a arquitetura dos tecidos e a sinalização. A expressão desregulada de MRC2/Endo180 está associada à remodelação fibrótica e à biologia da invasão no cancro, tornando-o relevante para estudos mecanísticos do comportamento celular dirigido pela matriz.

Endo180 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de MRC2 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Endo180 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus MRC2 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição MRC2, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Endo180. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus MRC2 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Endo180 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Endo180 em células tumorais com expressão de MRC2 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.