eIF4B Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402494-ACT

L’EIF4B umano codifica eIF4B, un fattore di inizio della traduzione che potenzia l’attività di elicasi dell’RNA di eIF4A e favorisce il reclutamento del complesso di preiniziazione 43S su mRNA con strutture secondarie, aumentando così l’efficienza della traduzione cap-dipendente. eIF4B è regolato dai segnali indotti da fattori di crescita e nutrienti, inclusi i pathway PI3K–AKT–mTOR e MAPK, tramite eventi di fosforilazione che modulano il caricamento dei ribosomi e i tassi di sintesi proteica. Influenzando la traduzione di trascritti coinvolti in proliferazione, risposte allo stress e sopravvivenza, EIF4B contribuisce a programmi cellulari quali la progressione del ciclo cellulare e il controllo traduttivo adattativo. Un’attività e una fosforilazione di eIF4B deregolate sono state associate a un output traduttivo alterato nella biologia dei tumori e in altre patologie in cui il controllo della sintesi proteica risulta compromesso.

eIF4B Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di EIF4B senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

eIF4B Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus EIF4B nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione EIF4B, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di eIF4B. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus EIF4B nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da eIF4B nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via eIF4B nelle cellule tumorali con espressione di EIF4B silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.