eIF2C1 Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-437349-ACT

Ago1 del topo codifica eIF2C1, una proteina della famiglia Argonaute che lega piccoli RNA e funge da effettore centrale dell’interferenza a RNA. eIF2C1 partecipa al silenziamento genico post-trascrizionale guidato da miRNA e siRNA, influenzando la stabilità e la traduzione degli mRNA e modellando programmi di espressione genica legati a differenziamento, proliferazione e risposte allo stress. Attraverso interazioni all’interno del complesso RISC e di vie correlate dei piccoli RNA, Ago1 contribuisce alla regolazione epigenetica e trascrizionale in molteplici tessuti. La deregolazione delle reti di piccoli RNA dipendenti da Argonaute è stata associata ad alterazioni della segnalazione immunitaria, fenotipi del neurosviluppo e stati trascrizionali oncogenici, rendendo Ago1 un nodo rilevante per studi meccanicistici dei circuiti di regolazione genica.

eIF2C1 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Ago1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

eIF2C1 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Ago1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Ago1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di eIF2C1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Ago1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da eIF2C1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via eIF2C1 nelle cellule tumorali con espressione di Ago1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.