EGFL8 CRISPR Activation Plasmid (m): sc-429875-ACT

Egfl8 kodiert EGFL8, ein sezerniertes, mit der extrazellulären Matrix assoziiertes Protein mit EGF-ähnlichen Domänen, das die Zell-Zell- und Zell-Matrix-Kommunikation unterstützt. In Mausgeweben wurde die EGFL8-Expression mit der Regulation der Entwicklungsmusterbildung sowie mit dem Verhalten von Epithel- und Endothelzellen und extrazellulären Umbauprozessen in Verbindung gebracht, die Adhäsion, Migration und Gewebeorganisation beeinflussen. Über diese Funktionen ist EGFL8 für Signalgebungskontexte relevant, die Morphogenese und Stroma-Parenchym-Interaktionen koordinieren, einschließlich Signalwege, die mit wachstumsfaktor-abhängigen Programmen verknüpft sind. Eine veränderte EGFL8-Aktivität oder -Expression wird daher in Modellen einer fehlregulierten Gewebeumgestaltung und der Biologie proliferativer Erkrankungen untersucht, bei denen Veränderungen im Mikromilieu das Zellschicksal und invasionsassoziierte Phänotypen prägen können.

EGFL8 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Egfl8-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

EGFL8 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Egfl8-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Egfl8-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen EGFL8-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Egfl8-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von EGFL8-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des EGFL8-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Egfl8-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.