E2F-6 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403615-ACT

E2F6 kodiert E2F-6, einen atypischen Transkriptionsregulator der E2F-Familie, der überwiegend als transkriptioneller Repressor unabhängig von einer RB-Bindung wirkt. Er trägt zur Kontrolle des Zellzyklus und zur Differenzierung bei, indem er E2F-responsive Gene, die an der DNA-Replikation und am Eintritt in die S-Phase beteiligt sind, stilllegt, und er ist an einer chromatinassoziierten Repression durch Rekrutierung von Polycomb-Gruppen-Komplexen beteiligt. Über diese Mechanismen hilft E2F-6, während der Entwicklung und bei Übergängen zwischen zellulären Zuständen angemessene Transkriptionsprogramme aufrechtzuerhalten. Eine Fehlregulation der E2F6-Aktivität wurde in der Krebsbiologie mit veränderter Proliferation und epigenetischer Kontrolle in Verbindung gebracht, was E2F6 für Studien zu onkogenen Transkriptionsnetzwerken und zur Linienplastizität relevant macht.

E2F-6 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen E2F6-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

E2F-6 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des E2F6-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der E2F6-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen E2F-6-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native E2F6-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von E2F-6-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des E2F-6-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem E2F6-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.