DZIP3 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403972-ACT

Il DZIP3 umano codifica una ligasi E3 dell’ubiquitina di tipo RING, implicata nel turnover proteico dipendente dall’ubiquitina e nella regolazione della trasduzione del segnale all’interfaccia tra membrana cellulare e citoscheletro. Attraverso l’ubiquitinazione selettiva dei substrati, DZIP3 può influenzare la proteostasi, il traffico intracellulare e le transizioni di stato cellulare che dipendono da un rimodellamento coordinato dei complessi proteici. La deregolazione dei componenti della via ubiquitina–proteasoma, incluse le ligasi E3, è spesso associata ad alterazioni dei programmi di proliferazione, differenziamento e risposta allo stress, rilevanti per la ricerca in oncologia e neurobiologia. DZIP3 è quindi di interesse per analizzare il controllo mediato dall’ubiquitina degli output trascrizionali e della responsività delle vie di segnalazione in modelli cellulari umani.

DZIP3 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di DZIP3 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

DZIP3 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus DZIP3 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione DZIP3, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di DZIP3. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus DZIP3 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da DZIP3 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via DZIP3 nelle cellule tumorali con espressione di DZIP3 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.