Plásmido CRISPR de Activación (h) Dok-2: sc-405016-ACT

El gen humano DOK2 codifica Dok-2, una proteína adaptadora que se acopla a tirosina quinasas de receptores y no receptores activadas para coordinar la señalización aguas abajo mediante sus dominios de homología con pleckstrina y de unión a fosfotirosina. Dok-2 es un modulador clave de las vías de inmunorreceptores y citocinas en células hematopoyéticas, ajustando la amplitud de la señal de receptores como los que activan quinasas de la familia Src e influyendo en salidas asociadas a MAPK y PI3K. Al ensamblar complejos multiproteicos que impactan las cascadas de fosforilación, contribuye al control de la activación, la proliferación y la diferenciación celular. La alteración de la expresión de DOK2 o del equilibrio de su señalización se ha asociado con respuestas inmunitarias desreguladas y con contextos de señalización relevantes para neoplasias hematológicas, lo que respalda su uso como nodo mecanístico en estudios de vías de enfermedad.

Dok-2 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de DOK2 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

Dok-2 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus DOK2 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional DOK2, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de Dok-2. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo DOK2 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de Dok-2 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía Dok-2 en células tumorales con expresión de DOK2 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.