Dnmt1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400272-ACT

DNMT1 kodiert die DNA-(Cytosin-5)-Methyltransferase 1 (Dnmt1), die wichtigste Erhaltungs-Methyltransferase, die während der S-Phase CpG-Methylierungsmuster auf neu synthetisierte DNA-Stränge überträgt. Durch Interaktionen mit UHRF1, PCNA und replikationsgekoppelten Chromatin-Maschinerien bewahrt Dnmt1 das epigenetische Gedächtnis und unterstützt Genomstabilität, genomische Prägung (Imprinting) sowie die X-Chromosom-Inaktivierung. Die DNMT1-Aktivität prägt Transkriptionsprogramme über Wechselwirkungen mit Histonmodifikationen und Chromatin-Remodelling und beeinflusst so Zellidentität und Differenzierung. Eine fehlregulierte DNMT1-Funktion und abweichende DNA-Methylierung stehen mit onkogener epigenetischer Reprogrammierung, veränderten DNA-Reparaturantworten und neuroentwicklungsbezogenen Phänotypen in Zusammenhang, was DNMT1 zu einem zentralen Ziel für mechanistische Studien zur Aufrechterhaltung des Epigenoms macht.

Dnmt1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen DNMT1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Dnmt1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des DNMT1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der DNMT1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Dnmt1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native DNMT1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Dnmt1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Dnmt1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem DNMT1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.