DNA pol δ 4 Plasmide di attivazione CRISPR (h2): sc-408268-ACT-2

Il gene umano POLD4 codifica la subunità 4 della DNA polimerasi delta (Pol δ4), un componente accessorio dell’oloenzima Pol δ che sostiene la sintesi del DNA del filamento ritardato ad alta fedeltà durante la replicazione e contribuisce anche alla sintesi di riparazione del DNA. Come parte della macchina replicativa, POLD4 opera all’interno delle principali vie che regolano l’avanzamento della forcella di replicazione, la maturazione dei frammenti di Okazaki e i checkpoint di stabilità del genoma, coordinandosi con l’attività della polimerasi dipendente da PCNA. Alterazioni nel bilanciamento delle subunità di Pol δ o stress replicativo che coinvolga POLD4 sono stati associati a un aumento del carico mutazionale e dell’instabilità cromosomica, caratteristiche frequentemente osservate nel cancro e in altri disturbi della manutenzione del genoma. L’editing genico mirato su POLD4 e i saggi funzionali consentono di studiare l’assemblaggio del complesso polimerasico, la scelta tra vie di replicazione e riparazione e le conseguenze cellulari di una fedeltà della sintesi del DNA compromessa in sistemi modello umani.

DNA pol δ 4 Il plasmide di attivazione CRISPR (h2) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di POLD4 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

DNA pol δ 4 Il plasmide di attivazione CRISPR (h2) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus POLD4 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione POLD4, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di DNA pol δ 4. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus POLD4 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da DNA pol δ 4 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via DNA pol δ 4 nelle cellule tumorali con espressione di POLD4 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.