DNA pol δ 3 Plasmide di attivazione CRISPR (h2): sc-411506-ACT-2

Il gene umano POLD3 codifica la subunità 3 della DNA polimerasi delta (DNA pol δ 3), un componente accessorio dell’oloenzima polimerasi δ che aumenta la sintesi processiva del DNA e supporta la replicazione del filamento ritardato dipendente da PCNA. POLD3 contribuisce al mantenimento del genoma svolgendo ruoli nella riparazione del DNA e nella tolleranza al danno, inclusa la risintesi del DNA durante la ricombinazione omologa e altri processi di riparazione associati alla replicazione che stabilizzano le forcelle replicative bloccate. L’alterazione della funzione di POLD3 è stata collegata a stress replicativo, a un aumento del carico mutazionale e all’instabilità genomica osservati in molteplici contesti oncologici, rendendolo rilevante per studi sull’evoluzione tumorale e sulle dipendenze dai meccanismi di riparazione del DNA. Strumenti di editing genetico mirati a POLD3 sono utili per analizzare le vie di riparazione accoppiate alla replicazione, mappare interazioni di letalità sintetica all’interno della rete di risposta al danno del DNA e valutare gli effetti sulla progressione del ciclo cellulare e sull’integrità del genoma in modelli cellulari umani.

DNA pol δ 3 Il plasmide di attivazione CRISPR (h2) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di POLD3 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

DNA pol δ 3 Il plasmide di attivazione CRISPR (h2) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus POLD3 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione POLD3, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di DNA pol δ 3. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus POLD3 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da DNA pol δ 3 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via DNA pol δ 3 nelle cellule tumorali con espressione di POLD3 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.