DHODH CRISPR Activationプラスミド (h): sc-402983-ACT

ヒトDHODHは、ジヒドロオロト酸脱水素酵素（dihydroorotate dehydrogenase）をコードする。これはフラビン依存性のミトコンドリア内膜酵素であり、ジヒドロオロト酸をオロト酸へ酸化することでデノボピリミジン生合成の第4段階を触媒し、その際ユビキノンを介して電子伝達系へ電子を受け渡すように電子移動を共役させる。細胞内のピリミジンヌクレオチド利用可能量を制御することで、DHODHはDNA/RNA合成、細胞周期の進行、増殖時およびストレス条件下での代謝適応を支える。DHODH活性はミトコンドリアのレドックスバランスやヌクレオチド恒常性経路と連関し、複製ストレス応答に影響を及ぼす。ピリミジン代謝の破綻およびDHODH依存的な生体エネルギー共役は、増殖性疾患の病態生物学や免疫細胞活性化に関与することが示唆されており、DHODHは代謝的脆弱性を扱う研究における共通の機序的ハブとなっている。

DHODH CRISPR活性化プラスミド（h）は、基盤となるDNA配列を変更することなく、内因性DHODHの発現を標的化し、非破壊的にアップレギュレートするアプローチを提供します。

DHODH CRISPR 活性化プラスミド (h) は、ヒト細胞株における DHODH 遺伝子座の高効率かつ部位特異的な転写アップレギュレーションのために設計された、3 つのプラスミドからなる相乗的活性化メディエーター (SAM) システムです。このシステムは、DNA結合能を維持しつつヌクレアーゼ活性を失わせる2つの不活性化変異（D10AおよびN863A）を有する、触媒活性のないCas9（dCas9）を中核としています。このdCas9は、強力な転写活性化因子であるVP64と融合しており、選別用のブラスティシジン耐性遺伝子と共に共発現します。2番目のプラスミドは、dCas9-VP64と協調して機能する二次活性化複合体であるMS2-p65-HSF1融合タンパク質をコードしており、ヒグロマイシン耐性遺伝子と共に発現する。3番目のプラスミドは、標的特異的な20塩基対のsgRNAをコードしており、これはMS2-p65-HSF1複合体を活性化部位に誘導する2つのMS2 RNAアプタマーと融合しており、さらにピューロマイシン耐性遺伝子が付随している。これら3つのプラスミドは、システム構成要素すべてが均等に発現するよう、質量比1:1:1で導入される。

標的遺伝子座に集合すると、SAM複合体はDHODH転写開始点の上流約200 bpの領域に結合し、そこでVP64、p65、およびHSF1が協調して転写装置を動員し、内因性DHODHの発現上昇を促進する。ヌクレアーゼ活性を持つCas9とは異なり、 dCas9は二本鎖切断を導入したりゲノム配列を改変したりしないため、天然のDHODH遺伝子座が保持され、内因性遺伝子座におけるDHODH依存性の転写応答の研究が可能となります。これにより、機能解析、標的遺伝子の同定、およびDHODH発現が沈黙または低下した腫瘍細胞におけるDHODH経路の回復のモデル化を行う上で、貴重なツールとなります。

研究用のみ。診断用または治療用ではありません。