Delta-3 Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-420011-ACT

Il gene Dll3 del topo codifica Delta-3, un ligando atipico della famiglia Notch che modula principalmente la segnalazione dei recettori Notch durante lo sviluppo embrionale e il patterning tissutale. Delta-3 è arricchito nel mesoderma presomitico, dove contribuisce all’orologio della segmentazione e alla formazione dei confini dei somiti tramite la regolazione della dinamica della via Notch e dell’inibizione laterale. Modellando le decisioni di destino cellulare e i programmi di differenziazione, Dll3 influenza le linee neurogeniche e miogeniche e processi morfogenetici più ampi. Una segnalazione Notch associata a DLL3 deregolata è stata collegata ad anomalie dello sviluppo ed è frequentemente utilizzata come marcatore di ricerca nella biologia dei tumori neuroendocrini, a supporto di studi meccanicistici sul controllo della via.

Delta-3 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Dll3 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Delta-3 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Dll3 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Dll3, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Delta-3. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Dll3 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Delta-3 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Delta-3 nelle cellule tumorali con espressione di Dll3 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.