DEC2 CRISPR Activation Plasmid (m): sc-429771-ACT

Bhlhe41 kodiert DEC2, einen basischen Helix-Loop-Helix-(bHLH)-Transkriptionsfaktor, der an E-Box-Motive bindet und zirkadiane Gennetzwerke sowie transkriptionelle Rückkopplungsschleifen moduliert. Bei der Maus ist DEC2 an der Regulation des Schlaf-Wach-Rhythmus, der neuronalen Erregbarkeit und der metabolischen Homöostase beteiligt, indem es mit zentralen Komponenten der inneren Uhr interagiert und nachgeschaltete rhythmische Transkription steuert. Das Protein beeinflusst außerdem abstammungslinienassoziierte Transkriptionsprogramme und verknüpft so Umweltreize mit Übergängen des Zellzustands. Eine veränderte DEC2-Aktivität wurde mit Phänotypen der Schlafdauer sowie mit einer weiter gefassten Dysregulation zirkadian gesteuerter Signalwege in Verbindung gebracht, die für Neurobiologie und systemischen Stoffwechsel relevant sind.

DEC2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Bhlhe41-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

DEC2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Bhlhe41-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Bhlhe41-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen DEC2-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Bhlhe41-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von DEC2-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des DEC2-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Bhlhe41-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.