Plasmide CRISPR d'Activation (h) DANGER: sc-407681-ACT

ITPRIP code DANGER (ITPRIP), un régulateur enrichi dans les neurones qui s’associe à la signalisation du récepteur de l’inositol 1,4,5-trisphosphate et peut influencer la dynamique intracellulaire du Ca2+ liée à la libération de calcium depuis le RE. DANGER a été décrit comme modulant des voies sensibles au stress et une signalisation liée à l’apoptose, notamment via des interactions associées à la régulation des caspases, orientant ainsi les décisions de survie cellulaire en conditions excitotoxiques ou protéotoxiques. Par son couplage à des réseaux de signalisation dépendants du calcium, DANGER est pertinent pour l’étude de la fonction synaptique, des réponses au stress mitochondrial et des programmes transcriptionnels en aval. Une homéostasie calcique dérégulée et une signalisation altérée liée à DANGER ont été impliquées dans des mécanismes pertinents pour la neurodégénérescence et des modèles de lésion neuronale.

DANGER Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de ITPRIP sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

DANGER Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus ITPRIP dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription ITPRIP, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de DANGER. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus ITPRIP natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de DANGER au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie DANGER dans les cellules tumorales présentant une expression de ITPRIP silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.