cystatin C Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402420-ACT

CST3 codifica la cistatina C, un inibitore secreto delle proteasi cisteiniche che limita l’attività delle catepsine e di altre proteasi lisosomiali/endosomiali, contribuendo a mantenere il turnover della matrice extracellulare, la processazione degli antigeni e la proteostasi. Modulando l’attività proteasica nel sistema endolisosomiale e nello spazio pericellulare, la cistatina C influenza la segnalazione infiammatoria, la migrazione cellulare e il rimodellamento dei tessuti. Alterazioni dell’espressione di CST3 o dei livelli di cistatina C sono state associate a processi neurodegenerativi, a patologie cerebrovascolari e ad aspetti della biologia renale e cardiovascolare, rendendola un nodo utile per studiare l’equilibrio tra proteasi e inibitori nei diversi tessuti. Nei modelli cellulari, la perturbazione di CST3 può essere impiegata per esplorare le vie che collegano la funzione lisosomiale, le risposte allo stress ossidativo e l’attivazione dell’immunità innata.

cystatin C Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di CST3 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

cystatin C Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus CST3 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione CST3, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di cystatin C. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus CST3 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da cystatin C nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via cystatin C nelle cellule tumorali con espressione di CST3 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.