Cyr61/CCN1 Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-421062-ACT

Cyr61 (CCN1) codifica una proteina secreta, matricellulare, che si lega a integrine e proteoglicani eparan solfato per regolare l’adesione, la migrazione, la proliferazione e la sopravvivenza cellulare all’interno della matrice extracellulare. CYR61/CCN1 partecipa a programmi di angiogenesi e riparazione delle ferite e coordina la segnalazione attraverso le vie della focal adhesion kinase, MAPK/ERK e PI3K/AKT, modulando al contempo il rimodellamento del citoscheletro. Nei modelli murini, un’attività alterata di Cyr61 è stata associata a rimodellamento tissutale disregolato, infiammazione e risposte fibrotiche, ed è frequentemente studiata nel contesto della biologia vascolare e del crosstalk stroma-epitelio. Poiché CCN1 integra segnali meccanici e infiammatori, rappresenta un nodo utile per indagare la regolazione genica guidata dal microambiente in contesti di sviluppo e in stati rilevanti per la malattia.

Cyr61/CCN1 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Cyr61 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Cyr61/CCN1 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Cyr61 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Cyr61, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Cyr61/CCN1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Cyr61 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Cyr61/CCN1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Cyr61/CCN1 nelle cellule tumorali con espressione di Cyr61 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.