COX4 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400616-ACT

Il gene umano **COX4I1** codifica la subunità IV dell’ossidasi del citocromo c, isoforma 1 (COX4), un componente strutturale del complesso IV mitocondriale codificato dal nucleo, che contribuisce a regolare il trasferimento di elettroni dal citocromo c all’ossigeno molecolare e supporta la fosforilazione ossidativa. Influenzando l’attività del complesso IV, COX4 contribuisce al mantenimento del potenziale di membrana mitocondriale, alla produzione di ATP e all’omeostasi delle specie reattive dell’ossigeno, integrandosi in programmi bioenergetici e di risposta allo stress più ampi. L’espressione di COX4I1 e la stechiometria del complesso IV vengono spesso valutate in studi sulla disfunzione mitocondriale, sull’adattamento all’ipossia e sulla riprogrammazione metabolica che accompagnano stati patologici proliferativi e degenerativi. In quanto marcatore fondamentale dell’integrità della catena respiratoria, COX4 è comunemente utilizzata per collegare i cambiamenti nella biogenesi mitocondriale e nella proteostasi ad alterazioni del metabolismo cellulare.

COX4 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di COX4I1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

COX4 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus COX4I1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione COX4I1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di COX4. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus COX4I1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da COX4 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via COX4 nelle cellule tumorali con espressione di COX4I1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.