COL12A1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402361-ACT

COL12A1 codifica la catena alfa 1 del collagene di tipo XII, un collagene associato alle fibrille con tripla elica interrotta (FACIT) che si localizza nella matrice extracellulare e si lega alle fibrille contenenti collagene I per regolare la fibrillogenesi, l’organizzazione della matrice e le proprietà meccaniche dei tessuti. È arricchito nei tessuti connettivi e contribuisce all’adesione cellula–matrice, alla meccanotrasduzione e al rimodellamento coordinato durante lo sviluppo e la riparazione. Alterazioni dell’espressione o della funzione di COL12A1 sono collegate a malattie ereditarie del tessuto connettivo con fenotipi muscoloscheletrici, a riflesso del suo ruolo nell’integrità di tendini e legamenti e nelle interfacce cartilagine-osso. In biologia del cancro e nel rimodellamento fibrotico, COL12A1 è spesso studiato come componente stromale della matrice extracellulare associata alla rigidità della matrice e a microambienti invasivi.

COL12A1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di COL12A1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

COL12A1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus COL12A1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione COL12A1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di COL12A1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus COL12A1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da COL12A1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via COL12A1 nelle cellule tumorali con espressione di COL12A1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.