CLN1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-404018-ACT

PPT1 kodiert Palmitoyl-Protein-Thioesterase 1 (CLN1), ein lysosomales depalmitoylierendes Enzym, das thioestergebundene Fettsäure-Acylgruppen von S-acylierten Proteinen entfernt und dadurch deren Abbau und Transport unterstützt. Durch die Regulation der lysosomalen Proteostase und des Abbaus lipidmodifizierter Proteine beeinflusst CLN1 die endolysosomale Dynamik, die Autophagie-Lysosomen-Funktion und die neuronale Homöostase. Ein Verlust der PPT1-Aktivität ist mit der neuronalen Ceroid-Lipofuszinose (CLN1-Erkrankung) verknüpft, die durch die Anreicherung autofluoreszierenden Speichermaterials und eine fortschreitende Neurodegeneration gekennzeichnet ist. PPT1/CLN1 wird daher breit in der Lysosomenbiologie, der Proteinkontrolle (Protein Quality Control) und den Mechanismen neurodegenerativer Speichererkrankungen untersucht.

CLN1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen PPT1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

CLN1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des PPT1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der PPT1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen CLN1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native PPT1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von CLN1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des CLN1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem PPT1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.