claudin-8 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-404251-ACT

CLDN8 codifica la claudina-8, una proteina tetraspanning delle tight junction che regola la permeabilità paracellulare e l’integrità della barriera epiteliale. La claudina-8 contribuisce all’organizzazione del complesso giunzionale apicale e alla sigillatura iono-selettiva negli epiteli polarizzati, integrandosi con vie che controllano polarità cellulare, adesione e trasporto transepiteliale. Un’alterata espressione di CLDN8 o una diversa localizzazione a livello giunzionale è associata a disfunzione epiteliale e a processi di rimodellamento osservati nei disturbi infiammatori e nelle modifiche delle proprietà di barriera associate al cancro. In quanto componente giunzionale, la claudina-8 è ampiamente utilizzata come marcatore e come punto di accesso meccanicistico per studiare la differenziazione epiteliale e la regolazione della permeabilità specifica di tessuto.

claudin-8 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di CLDN8 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

claudin-8 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus CLDN8 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione CLDN8, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di claudin-8. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus CLDN8 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da claudin-8 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via claudin-8 nelle cellule tumorali con espressione di CLDN8 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.