CHAC1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403197-ACT

CHAC1 (ChaC glutathione-specific gamma-glutamylcyclotransferase 1) è un enzima inducibile dallo stress che degrada il glutatione, collegando l’omeostasi redox al metabolismo degli amminoacidi e all’adattamento cellulare allo stress ossidativo e del reticolo endoplasmatico. In quanto effettore a valle della risposta integrata allo stress guidata da ATF4, CHAC1 influenza l’equilibrio delle specie reattive dell’ossigeno, la capacità di ripiegamento delle proteine e la suscettibilità a programmi di destino cellulare associati allo stress. Un’alterata espressione di CHAC1 è stata riportata in diversi contesti che coinvolgono stress metabolico e infiammazione, inclusi la biologia dei tumori e modelli di malattie neurodegenerative, nei quali la deplezione di glutatione e le vie correlate alla ferroptosi sono spesso oggetto di studio. La modulazione di CHAC1 offre un approccio gestibile per studiare come il turnover del glutatione rimodelli le reti di segnalazione, la funzione mitocondriale e i programmi trascrizionali responsivi allo stress nelle cellule umane.

CHAC1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di CHAC1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

CHAC1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus CHAC1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione CHAC1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di CHAC1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus CHAC1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da CHAC1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via CHAC1 nelle cellule tumorali con espressione di CHAC1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.