CD3-γ Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402537-ACT

CD3G codifica per CD3-γ, una componente essenziale del complesso recettoriale dei linfociti T (TCR)-CD3 che collega il riconoscimento dell’antigene alla trasduzione del segnale intracellulare. Attraverso l’assemblaggio con CD3δ, CD3ε e CD3ζ, CD3-γ contribuisce ad avviare cascate di segnalazione dipendenti dalla fosforilazione che coinvolgono LCK, ZAP70 e, a valle, le vie MAPK, NF-κB e NFAT, le quali regolano l’attivazione dei linfociti T, la proliferazione e la produzione di citochine. Un’espressione o una funzione alterata di CD3G può perturbare lo sviluppo dei timociti e le soglie di segnalazione del TCR, collegando questo gene a fenotipi di disregolazione immunitaria e a meccanismi associati all’immunodeficienza. In quanto subunità centrale del complesso TCR, CD3-γ è ampiamente studiata nella biologia dei linfociti, nella segnalazione dell’immunità adattativa e nel cross-talk tra vie di segnalazione che modella le risposte agli stimoli infiammatori.

CD3-γ Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di CD3G senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

CD3-γ Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus CD3G nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione CD3G, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di CD3-γ. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus CD3G nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da CD3-γ nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via CD3-γ nelle cellule tumorali con espressione di CD3G silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.