Plásmido CRISPR de Activación (h) CCT A: sc-404021-ACT

PCYT1A codifica la citidililtransferasa de colina-fosfato A (CCT A), la enzima limitante de la vía del CDP-colina (Kennedy) que genera fosfatidilcolina, un lípido estructural principal de las membranas eucariotas. Al controlar la síntesis de fosfatidilcolina, CCT A influye en la biogénesis de membranas, la dinámica de las gotas lipídicas y la homeostasis del RE y del aparato de Golgi, conectando la disponibilidad de lípidos con la función de los orgánulos y el crecimiento celular. La actividad de PCYT1A se integra con una remodelación más amplia de los fosfolípidos y con el metabolismo de las lipoproteínas, dando forma a la composición de la membrana y a su capacidad de señalización. La alteración de la función de PCYT1A se asocia con trastornos hereditarios del metabolismo de los fosfolípidos y puede afectar las respuestas celulares al estrés y los programas de diferenciación relevantes para fenotipos metabólicos y del neurodesarrollo.

CCT A El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de PCYT1A sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

CCT A El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus PCYT1A en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional PCYT1A, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de CCT A. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo PCYT1A y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de CCT A en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía CCT A en células tumorales con expresión de PCYT1A silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.