CCS CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402130-ACT

Humanes CCS (Copper Chaperone for Superoxide Dismutase) ist ein zytosolisches Metallochaperon, das Kupfer an SOD1 liefert und deren Reifung fördert. Dadurch unterstützt es die antioxidative Abwehr, indem es eine effiziente Dismutation von Superoxidradikalen ermöglicht. Durch die Regulation der Metallierung und Stabilität von SOD1 trägt CCS zur Redox-Homöostase, zur mitochondrialen Funktion und zur zellulären Widerstandsfähigkeit gegenüber oxidativem Stress in unterschiedlichen Zelltypen bei. Störungen in der Kupferhandhabung und in der Aktivität der SOD1/CCS-Achse sind für die neurodegenerative Forschung sowie für breitere Untersuchungen oxidativstress-assoziierter Pathologien relevant, einschließlich Entzündung und metabolischer Dysfunktion. CCS-Expression und -Funktion werden daher häufig in Modellen untersucht, die kupferabhängige Signalgebung, Proteostase und Stressantwort-Signalwege adressieren.

CCS Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen CCS-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

CCS Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des CCS-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der CCS-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen CCS-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native CCS-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von CCS-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des CCS-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem CCS-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.