Calpain 15 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-411016-ACT

Das humane CAPN15-Gen kodiert Calpain 15, ein atypisches Mitglied der Calpain-Familie calciumabhängiger Cysteinproteasen, die an der regulierten Proteolyse beteiligt sind und so Proteinturnover sowie Signalantworten mitgestalten. Calpain-Aktivität kann durch die begrenzte Spaltung von Substraten – statt durch massenhaften Abbau – das Zytoskelett-Remodeling, den vesikulären Transport und stressresponsive Signalwege beeinflussen und dadurch die zelluläre Homöostase feinjustieren. Die CAPN15-Expression wurde im Kontext der Gewebeentwicklung und der Regulation von Zellzuständen untersucht, wobei veränderte Protease-Signale Differenzierungsprogramme sowie neuronale oder epitheliale Funktionen beeinflussen können. Eine fehlregulierte, calpainassoziierte Proteolyse wurde in der Literatur mit Mechanismen in Verbindung gebracht, die für Neurodegeneration, Entzündung und krebsassoziierte Signalgebung relevant sind, was CAPN15 als Ziel für Pathway-Mapping und funktionelle Genomik unterstützt.

Calpain 15 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen CAPN15-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Calpain 15 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des CAPN15-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der CAPN15-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Calpain 15-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native CAPN15-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Calpain 15-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Calpain 15-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem CAPN15-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.