c-Mpl Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403035-ACT

MPL codifica il recettore della trombopoietina c-Mpl, un recettore delle citochine di classe I che regola il mantenimento delle cellule staminali e progenitrici ematopoietiche e promuove la proliferazione dei megacariociti e la produzione di piastrine. In seguito al legame con la trombopoietina, c-Mpl trasduce il segnale attraverso le vie JAK2/STAT5, MAPK/ERK e PI3K/AKT, coordinando sopravvivenza, differenziamento e programmi trascrizionali responsivi alle citochine. Una segnalazione o un’espressione di MPL deregolata è associata a un’emopoiesi aberrante ed è spesso studiata nel contesto delle neoplasie mieloproliferative e delle sindromi ereditarie di trombocitopenia. In quanto recettore di superficie con readout a valle ben definiti, c-Mpl rappresenta un nodo sperimentale maneggevole per analizzare la segnalazione citochinica, l’impegno di linea e l’emopoiesi da stress in modelli cellulari umani.

c-Mpl Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di MPL senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

c-Mpl Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus MPL nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione MPL, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di c-Mpl. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus MPL nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da c-Mpl nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via c-Mpl nelle cellule tumorali con espressione di MPL silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.