BUB3 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-402439-ACT

BUB3 codifica uma proteína central do checkpoint de montagem do fuso (SAC) que se localiza nos cinetócoros e ajuda a monitorar a ligação dos microtúbulos durante a mitose. Ao interagir com BUB1 e contribuir para o complexo de checkpoint mitótico, BUB3 restringe o início da anáfase por meio da regulação da atividade do APC/C e apoia a segregação fiel dos cromossomos. A perturbação da sinalização do checkpoint associada a BUB3 pode promover instabilidade cromossômica e aneuploidia, processos frequentemente examinados em estudos de tumorigenese e manutenção do genoma. Como resultado, BUB3 é amplamente usado como um ponto de entrada mecanístico para investigar a fidelidade mitótica, a sinalização em cinetócoros e respostas ao estresse dependentes do ciclo celular em células humanas.

BUB3 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de BUB3 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

BUB3 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus BUB3 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição BUB3, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de BUB3. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus BUB3 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de BUB3 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via BUB3 em células tumorais com expressão de BUB3 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.