Plasmide CRISPR d'Activation (h) BBS9: sc-404329-ACT

BBS9 code un composant essentiel du complexe BBSome, qui coordonne le trafic des protéines membranaires vers et depuis le cil primaire, contribuant ainsi à la composition de la membrane ciliaire et à la fidélité de la transduction des signaux. En s’associant à d’autres protéines BBS, BBS9 participe à des processus liés au transport intraflagellaire qui façonnent la ciliogenèse et régulent la localisation des récepteurs pour des voies telles que Hedgehog et d’autres réseaux de signalisation dépendants des cils. La perturbation de la fonction de BBS9 est associée à la biologie des ciliopathies, où un trafic ciliaire altéré peut affecter la mise en place des structures au cours du développement, la signalisation sensorielle et l’homéostasie énergétique. Ces caractéristiques font de BBS9 une cible utile pour étudier les mécanismes dépendants des cils, la dynamique du transport des récepteurs et les relations génotype–phénotype dans des modèles cellulaires humains.

BBS9 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de BBS9 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

BBS9 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus BBS9 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription BBS9, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de BBS9. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus BBS9 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de BBS9 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie BBS9 dans les cellules tumorales présentant une expression de BBS9 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.