Arc Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-419184-ACT

Arc murino (activity-regulated cytoskeleton-associated protein) è il prodotto di un gene immediato-precoce rapidamente indotto dall’attività neuronale e dalla segnalazione sinaptica. Arc regola la plasticità sinaptica controllando l’endocitosi e il traffico dei recettori AMPA, coordinando il rimodellamento del citoscheletro di actina e collegando la trascrizione dipendente dall’attività ai cambiamenti nella struttura delle spine dendritiche. Attraverso questi processi, Arc partecipa alle vie alla base del potenziamento e della depressione a lungo termine, del consolidamento della memoria e dello scaling omeostatico. Un’alterazione dell’espressione o della regolazione di Arc è spesso utilizzata come readout molecolare dell’attività dei circuiti ed è stata associata, in ambito di ricerca, a fenotipi neurosviluppativi e neuropsichiatrici, inclusi disfunzioni cognitive e connettività sinaptica aberrante.

Arc Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Arc senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Arc Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Arc nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Arc, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Arc. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Arc nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Arc nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Arc nelle cellule tumorali con espressione di Arc silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.