apoL1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403137-ACT

APOL1 codifica l’apolipoproteina L1 (apoL1), una proteina legante i lipidi implicata nella difesa immunitaria innata e nelle risposte allo stress cellulare. apoL1 è associata a membrane endosomiali e autofagiche ed è stata collegata alla regolazione del traffico vescicolare, delle vie di morte cellulare programmata e delle reti di segnalazione inducibili dall’interferone. Nei tipi cellulari rilevanti per il rene, l’espressione di APOL1 e l’attività dipendente dalle varianti sono state studiate nel contesto dell’omeostasi dei podociti, della disfunzione mitocondriale e della segnalazione infiammatoria. La biologia disregolata di APOL1 è ampiamente investigata per il suo contributo ai meccanismi alla base di fenotipi renali proteinurici e di modelli di danno mediato dal sistema immunitario.

apoL1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di APOL1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

apoL1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus APOL1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione APOL1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di apoL1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus APOL1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da apoL1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via apoL1 nelle cellule tumorali con espressione di APOL1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.