AP-3β Particelle di Attivazione Lentivirale (m): sc-419135-LAC

Ap3b1 codifica la subunità β1 del complesso adaptor protein-3 (AP-3), un adattatore di rivestimento fondamentale che media la selezione del carico e il traffico dal reticolo trans-Golgi e dai compartimenti endosomiali verso i lisosomi e gli organelli correlati ai lisosomi. AP-3β sostiene lo smistamento di proteine di membrana coinvolte nella biogenesi delle vescicole, nella maturazione degli organelli e nella secrezione regolata, influenzando vie quali il trasporto endolisosomiale e il ciclo delle vescicole sinaptiche in cellule specializzate. L’alterazione della funzione del complesso AP-3 perturba il traffico vescicolare ed è stata associata, nei sistemi modello, a difetti di pigmentazione, fenotipi del neurosviluppo e a una funzione modificata dei granuli delle cellule immunitarie. Di conseguenza, Ap3b1 è ampiamente studiato per comprendere i meccanismi di trasporto intracellulare, l’identità degli organelli e l’instradamento del carico specifico per tipo cellulare.

Le particelle di attivazione lentivirale AP-3β (m) rispondono a questa esigenza incapsulando il sistema completo di attivazione trascrizionale del mediatore di attivazione sinergica (SAM) in particelle lentivirali ad alto titolo pronte per la trasduzione, consentendo un'efficiente sovraregolazione di Ap3b1 in una gamma più ampia di tipi di cellule umane.

Le particelle di attivazione lentivirale AP-3β (m) veicolano tutti i componenti funzionali del sistema del mediatore di attivazione sinergica (SAM) tramite trasduzione lentivirale. Il sistema comprende tre preparati di particelle co-trasdotti nelle cellule bersaglio: uno che codifica per dCas9 cataliticamente inattivo (mutazioni D10A e N863A) fuso al dominio di transattivazione VP64 con un gene di resistenza alla blasticidina; una che codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1 con un gene di resistenza all'igromicina; e una che codifica un sgRNA di 20 nt specifico per il bersaglio fuso a due aptameri di RNA MS2 con un gene di resistenza alla puromicina. A seguito della trasduzione lentivirale e dell'integrazione genomica dei cassetti di espressione, i componenti del SAM vengono espressi in modo stabile e si assemblano nel locus bersaglio all'interno della regione promotrice prossimale a monte del sito di inizio della trascrizione Ap3b1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo cooperativo per reclutare il machinery trascrizionale endogeno e guidare una sovraregolazione sostenuta dell'espressione endogena di AP-3β. L'uso di dCas9 inattivo nei confronti delle nucleasi evita l'introduzione di rotture del DNA a doppio filamento e preserva il locus genomico nativo Ap3b1 e l'architettura regolatoria.

Il formato lentivirale offre diversi vantaggi pratici: l'integrazione genomica stabile supporta l'attivazione ereditaria attraverso le divisioni cellulari; le preparazioni di particelle ad alto titolo eliminano la necessità di una produzione virale interna; e la compatibilità con tipi di cellule primarie, non in divisione e resistenti alla trasfezione amplia l'accessibilità sperimentale. Il successo della trasduzione può essere confermato e potenziato attraverso una selezione antibiotica tripla utilizzando puromicina, igromicina e blasticidina.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.